Identificación de Especies y Subtipificación …

Identificación de Especies y Subtipificación ...

Centro de Enfermedades Infecciosas y Microbiología, Instituto de Patología Clínica e Investigación Médica, Westmead, Nueva Gales del Sur, Australia

Autor correspondiente. Dirección postal: Centro de Enfermedades Infecciosas y Microbiología, Instituto de Patología Clínica e Investigación Médica, Hospital Westmead, Darcy Rd. Westmead, Nueva Gales del Sur, Australia 2145. Teléfono: (612) 9845 6255. Fax: (612) 9893 8659. E-mail: ua.vog.wsn.shasw.rmpci@gnyl.

Recibido de 1999 1, Sep; Las revisiones solicitaron 1.999 11 Nov; Aceptado 1999 9 Dic.

Copyright 2000, Sociedad Americana de Microbiología

Abstracto

Se han presentado pruebas de que las especies actualmente conocidas como Ureaplasma urealyticum debe ser separado en dos nuevas especies, a saber, U. parvum (previamente U. urealyticum biovar 1) y U. urealyticum (previamente U. urealyticum biovar 2) (9). Ureaplasmas son comensales en el tracto genital, causas reconocidas de la enfermedad (15), y presuntos colaboradores de una serie de otras condiciones patológicas (1). Debido a que se encuentran comúnmente en las personas sanas, su papel patógeno puede ser difícil de probar (10. 18). La mayoría de las cepas humanas ureaplasma pertenecen a las especies nuevas propuestas U. parvum (1. 3. 5. 7. 8), que incluye serotipos 1, 3, 6 y 14. U. urealyticum (Biovar 2) se aísla menos a menudo, pero no es infrecuente. Algunos serotipos ureaplasma se han asociado con síndromes de enfermedades con mayor frecuencia que con la flora normal (19), pero los datos son limitados debido a las dificultades con los métodos convencionales de serotipificación. métodos moleculares rápidos para la identificación de especies y subtipos serían de gran valor en los estudios de la epidemiología y la patogénesis de las infecciones con U. parvum y U. urealyticum (8).

Recientemente, los métodos basados ​​en PCR han sido utilizados con éxito para distinguir los dos Ureaplasma especies (biovariedades), pero hay una necesidad de mejorar su especificidad y sensibilidad (2. 8). Las secuencias diana de las regiones espaciadoras intergénicas 16S rRNA genes y 16S rRNA 23S-rRNA (6. 12), las subunidades de genes de la ureasa (2. 11), y los 5 extremos del antígeno múltiple de bandas (MBA) genes (8. 16 . 17) todos han sido utilizados en ensayos basados ​​en PCR para diferenciar U. parvum de U. urealyticum. Anteriormente, hemos secuenciado porciones de estos genes de todo 14 Ureaplasma serovares (9) y se describen ensayos basados ​​en PCR para la identificación de U. parvum y U. urealyticum y los subtipos de U. parvum (8). En el presente estudio, se evaluó la especificidad de una gran variedad de cebadores y utilizamos un pequeño subconjunto de desarrollar un algoritmo para la detección, identificación de especies, y de subtipos de Ureaplasma especies.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas.

Los aislados clínicos y muestras.

Un total de 78 Ureaplasma aislados obtenidos de muestras vaginales de las mujeres embarazadas y recientemente cultivadas en nuestro laboratorio y 185 muestras vaginales obtenidas de mujeres embarazadas y las mujeres que asisten a una clínica de enfermedades de transmisión sexual y en el que Ureaplasma especies se habían detectado previamente (8) se utilizaron en este estudio.

Los cebadores de oligonucleótidos.

preparación de ADN y PCR.

subtipificación de U. urealyticum por secuenciación directa.

Algoritmo para la identificación y subtipificación de U. parvum y U. urealyticum .

Con el fin de desarrollar un esquema de identificación práctica y subtipos, hemos diseñado un algoritmo (fig. (Figura 1) 1) para uso clínico y luego lo aplicamos a todos los conocidos Ureaplasma serovares, en los conjuntos de ATCC y de referencia de la UAB y de los aislamientos clínicos y muestras clínicas.

Algoritmo para la identificación y subtipificación de U. parvum y U. urealyticum. Para la identificación de U. parvum y U. urealyticum (A), el resultado (tamaño de la banda) fue de 326 pb para U. parvum serovariedades 1 y 3/14 y 327 pb para U. parvum serotipo 6.

RESULTADOS

ITP.

La especificidad de U. parvum y U. urealyticum identificación y subtipificación cebadores.

Todas las cepas de referencia ATCC y de la UAB U. parvum y U. urealyticum fueron identificados correctamente con los cebadores especies y subtipo específico como se muestra en el algoritmo (Fig. (Fig.1 1).

U. parvum y U. urealyticum identificación de subtipos y resultados para los aislamientos clínicos y muestras clínicas.

De los 78 aislados clínicos, 62 (79,5) fueron identificados como U. parvum. 15 (19,2) fueron identificados como U. urealyticum. y 1 (1.3) se mezcló. De 185 muestras vaginales que se había demostrado previamente para contener Ureaplasma especies, 151 (81,6) contenían U. parvum solamente, 20 (10,8) contenían U. urealyticum solamente, y 14 (7,6) contenía ambos. Resultados de subtipificación de los aislados clínicos y Ureaplasma especies en muestras vaginales se muestran en la tabla Tabla2. 2.

DISCUSIÓN

Muchos de los objetivos de cebadores utilizados en este estudio se basaron en nuestra observación anterior de que la heterogeneidad de las regiones espaciadoras intergénicas es mayor que dentro de los genes (9). Creemos que cebadores basados ​​en estas regiones serían más discriminatorio para la identificación y subtipificación de Ureaplasma especies (9). Estos cebadores incluidos UPSA-UUSA (16S rRNA 23S rRNA genes regiones espaciadoras); UPS2-UPA2 y UUS2-UUA2 (ureaureB y ureBureC regiones de genes espaciadores, respectivamente); y UMS-57, UMS-61, UMS-83, UMS-54, UMS-112, y UMS-112 (aguas arriba de la MBA genes) (tabla (Tabla 1 1).

Las diferencias entre los dos propuestos nuevas especies en los genes 16S rRNA se han descrito anteriormente y se utiliza para diseñar específica biovar (o específico de la especie) primers (12). El par de cebadores U8-P6, diseñado para amplificar U. urealyticum (Biovar 2), el ADN también amplificado a partir de M. pneumoniae (12), que se encuentra no pocas veces en el tracto genital (14). Se diseñó un nuevo cebador, UUA, que fue emparejado con U8. Este par fue específico para U. urealyticum (Biovar 2) y no amplificar el ADN de dos M. pneumoniae cepas ATCC u otro Mycoplasma probados especies. dos nuevos U. parvum (Biovar 1) pares de cebadores específicos de, UPS1-UPA y UPS-UPA, también basado en el gen 16S rRNA, no amplificar el ADN de cualquiera U. urealyticum (Biovar 2) o la Mycoplasma probados especies.

Cebadores basados ​​en secuencias de genes de la ureasa y se utilizan para diferenciar U. parvum y U. urealyticum se han descrito previamente (2. 13). Se diseñaron dos conjuntos adicionales de cebadores específicos de especie, UPS2-UPA2 (U. parvum específico) y UUS2-UUA2 (U. urealyticum específica), dirigido a la ureaureB y ureBureC regiones espaciadoras gen, respectivamente. Ellos fueron específicos para todos los serovares dentro de las especies correspondientes (biovar) tanto para la ATCC y cepas de referencia de la UAB.

Habiendo confirmado la sensibilidad y especificidad de los nuevos pares de cebadores, se diseñó un algoritmo (Fig. (Fig.1) 1) para la identificación y subtipificación de U. parvum y U. urealyticum. utilizando una selección de los cebadores adecuadas. Su utilidad se evaluó con ATCC y de referencia UAB cepas, almacena los aislados clínicos, y Ureaplasma -muestras clínicas positivas. Los resultados sugieren que el algoritmo sería particularmente adecuado para su uso en estudios epidemiológicos. Identificación y subtipos de los aislados clínicos y muestras confirmaron la anterior conclusión de que U. parvum se encuentra mucho más comúnmente (87 de los aislados o muestras en total) de U. urealyticum (19) entre la flora vaginal (3). Ambos Ureaplasma Se detectaron las especies en 1 aislado clínico (1) y 14 muestras vaginales (8) (6 en total). Entre el U. parvum las cepas detectadas, serovariedades 3/14 (48) y 1 (43) fueron encontrados más comúnmente que serotipo 6 (23); 8 de los aislamientos y 16 de muestras vaginales (14 en total) contenían dos o más subtipos. U. urealyticum subtipos 1 (34) y 2 (62) fueron encontrados más comúnmente que el subtipo 3 (6). Sólo una cepa clínica que mezcló U. urealyticum subtipos.

En resumen, hemos diseñado una serie de nuevos pares de cebadores basados ​​en secuencias previamente reportadas de tres genes importantes ureaplasma y regiones adyacentes y modificado algunos cebadores publicados anteriormente para mejorar su sensibilidad y especificidad. Nuestra evaluación inicial del algoritmo para la identificación y subtipificación de U. parvum y U. urealyticum. usando un conjunto seleccionado de cebadores con ATCC y cepas de referencia de la UAB, aislados clínicos, y muestras clínicas, confirmaron su especificidad y sensibilidad. Se requiere una evaluación adicional de su sensibilidad para el examen directo de muestras clínicas. Sin embargo, creemos que, en el futuro, van a ayudar en los estudios sobre la epidemiología, patogenicidad, y la importancia clínica de Ureaplasma especies en los seres humanos y proporcionará ventajas significativas sobre los métodos convencionales de serotipificación.

Referencias

2. Blanchard A. Ureaplasma urealyticum genes de ureasa: uso de un codón UGA triptófano. Mol Microbiol. 1990; 4: 669-676. [PubMed]

4. Cunliffe N A, S Fergusson, Davidson F, Lyon A, Ross P W. Comparación de la cultura con la reacción en cadena de la polimerasa para la detección de Ureaplasma urealyticum en los aspirados endotraqueales de los recién nacidos prematuros. J Med Microbiol. 1996; 45: 27-30. [PubMed]

5. Grattard M, Pozzetto B, de B Barbeyrac B, Renaudin H, M Clerc, Gaudin O G, PCR Bebear C. cebados arbitrariamente-confirma la diferenciación de cepas de Ureaplasma urealyticum en dos biotipos. Cell Probes Mol. 1995; 9: 383-389. [PubMed]

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Se proporcionan artículos de Journal of Clinical Microbiology aquí por cortesía de Sociedad Americana de Microbiología (ASM)

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